Concanavalin A . के माध्यम से टी सेल सक्रियण

परिचय
टी कोशिकाओं को एक मौन अवस्था से विभेदन और विस्तार के लिए बाहरी संकेतों की आवश्यकता होती है। Concanavalin A (con A) एक एंटीजन-स्वतंत्र माइटोजन है और इसे वैकल्पिक T सेल उत्तेजना के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। टी सेल उत्तेजना प्रयोगों में एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं के लिए इस लेक्टिन को अक्सर सरोगेट के रूप में उपयोग किया जाता है। Concanavalin A अपरिवर्तनीय रूप से कोशिका की सतह पर ग्लाइकोप्रोटीन को बांधता है और टी कोशिकाओं को प्रसार के लिए प्रतिबद्ध करता है। यह प्रतिलेखन कारकों और साइटोकिन उत्पादन को प्रोत्साहित करने का एक त्वरित तरीका है।

सामग्री
T25 या T75 स्टेराइल फ्लास्क जिसमें वेंटेड कैप (जैसे, Nunc EasYFlask सेल कल्चर फ्लास्क, T25, फिल्टर, कैट नंबर 156367)
RPMI 1640 मीडियम (जैसे, बेंचस्टेबल RPMI 1640 मीडियम, कैट नंबर A4192301)
भ्रूण गोजातीय सीरम (जैसे। , गिब्को फेटल बोवाइन सीरम, कैट नंबर 26140087, या फेटल बोवाइन सीरम वन शॉट फॉर्मेट, कैट नंबर ए3160401)
एल-ग्लूटामाइन (जैसे, 200 एमएम एल-ग्लूटामाइन, कैट। नंबर 25030149)
वैकल्पिक: पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (जैसे , गिब्को पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, कैट नं। १५१४०१४८)
कॉनकानावलिन ए (जैसे, ईबायोसाइंस कॉनकैनावलिन ए सॉल्यूशन, ५००एक्स, कैट। नंबर ००-४९७८-९३)
सेल स्क्रैपर (जैसे, नून सेल स्क्रेपर्स, कैट नंबर १७९६३)

 

प्रक्रिया

  • बाँझ परिस्थितियों में सड़न रोकनेवाला तकनीकों का उपयोग करना, पीबीएमसी को पूरे रक्त (पूरक प्रोटोकॉल ए) या तैयार लिम्फोइड ऊतक (पूरक प्रोटोकॉल बी) से अलग करें।
  • भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ आरपीएमआई १६४० माध्यम को १०% और २ एमएम एल-ग्लूटामाइन (यदि वर्तमान में ग्लूटामैक्स के साथ पूरक नहीं है) का उपयोग करके पूरा आरपीएमआई १६४० माध्यम तैयार करें। मध्यम को ३७ डिग्री सेल्सियस पर लाएं। वैकल्पिक:  1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (५,००० यूनिट/एमएल) के साथ अनुपूरक मीडिया।
  •  पूर्ण RPMI १६४० माध्यम में ३ x १०  कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें । आपके द्वारा उपयोग किए जा रहे फ्लास्क के आकार (T25 या T75) के आधार पर आवश्यक मात्रा तैयार करें।
  • 2 कल्चर फ्लास्क तैयार करें: एक को ‘कॉन ए उत्तेजित’ (सक्रिय) और दूसरे को ‘गैर-उत्तेजित’ (गैर-सक्रिय) के रूप में लेबल किया गया।
  1. सेल समाधान (चरण 3 में तैयार) को समान रूप से तैयार फ्लास्क में विभाजित करें।
  1. concanavalin को 1X (2 µ l/mL) की सांद्रता पर कॉन A उत्तेजित (सक्रिय) फ्लास्क में जोड़ें।
  1.  ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 1-3 दिनों के लिए फ़िल्टर्ड वेंटेड कैप्स और इनक्यूबेट फ्लास्क के साथ दोनों फ्लास्क को कवर करें ।
  1. सेल खुरचनी के साथ हार्वेस्ट सेल।

 

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